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Labor bei der HPV-Diagnostik

Molekularbiologische Methoden

RT-PCR-HPV-NACHWEIS

Die von uns verwendeten HR-HPV-Methoden nutzen die Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Technologie und erfüllen die Vorgaben der neuen Richtlinie.

Diese Methoden nutzen spezifische Gensequenzen für den HPV-Nachweis und ermöglichen es, zwischen bestimmten HPV-Genotypen zu unterscheiden. Mittlerweile sind mehr als 220 unterschiedliche HPV-Typen identifiziert, die in Hochrisiko- und Niedrigrisikotypen (HR- und LR-HPV) unterteilt werden. Obwohl die HR-HPV-Infektion einer der Hauptgründe für die Ausbildung eines Zervixkarzinoms ist, sind nicht alle Zervixkarzinome HPV-positiv1.

Beide Methoden erfüllen die klinisch-internationalen Richtlinien (Meijer Kriterien) für HPV-Nachweisverfahren3.

Der BD Onclarity™ HPV-Test der Firma Becton Dickinson wird auf dem CE-IVD zertifizierten BD COR™ System ausgeführt. Der HPV-Test weist simultan die 14 geforderten HR-HPV-Genotypen nach. Dabei ermöglicht er sowohl den Nachweis einzelner Genotypen (16, 18, 45, 31, 51 und 52) als auch einen Gruppennachweis (33/58, 56/59/66 und 35/39/68) und deckt damit die wichtigsten krebserregenden HR-HPV-Genotypen ab. Zur Identifikation werden genotypspezifische Primer und Sonden verwendet. Die Zielsequenz für den HPV-Nachweis sind die Proteine E6 und E7. Diese Onkogene tragen zur malignen Progression bei, indem sie durch eine Überexpression eine zunehmende Instabilität des Genoms der Wirtszelle bewirken2. Es sind keine Kreuzreaktivitäten mit LR-HPV-Genotypen bekannt. Der Test hat eine FDA-Zulassung. Detaillierte Informationen zum Testverfahren finden sich hier.

Der Alinity m HR HPV-Test der Firma Abbott Molecular wird auf dem CE-IVD zertifizierten Alinity m™ System ausgeführt. Der HPV-Test weist ebenfalls simultan die 14 geforderten HR-HPV-Genotypen nach. Dabei ermöglicht er sowohl den Nachweis einzelner Genotypen (16, 18, 45,) als auch einen Gruppennachweis (31/ 33/ 52/ 58 und 35/ 39/ 51/ 56/ 59/ 66/ 68) und deckt damit die wichtigsten krebserregenden HR-HPV-Genotypen ab. Die Zielsequenz für den HPV-Nachweis ist die L1 Region. Bislang sind keine Kreuzreaktivitäten mit LR-HPV-Genotypen bekannt. Detaillierte Informationen zum Testverfahren finden sich hier.

1 de Sanjose, S., Quint, W. G., Alemany, L., Geraets, D. T., Klaustermeier, J. E., Lloveras, B., ... & Vallejos, C. S. (2010). Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional worldwide study. The lancet oncology, 11(11), 1048-1056.

2 Doorbar, J. (2006). Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer. Clinical science, 110(5), 525-541.

3 Meijer, C. J., Berkhof, J., Castle, P. E., Hesselink, A. T., Franco, E. L., Ronco, G., ... & Heideman, D. A. (2009). Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. International journal of cancer, 124(3), 516-520.

Indikationen der HPV Diagnostik

Die seit dem 01. Januar 2020 geltende Krebsfrüherkennungsrichtlinie sieht veränderte Indikationsstellungen und Empfehlungen vor. Zwar haben die Frauen weiterhin erstmalig ab dem Alter von 20 Jahren Anspruch auf die Früherkennungsuntersuchung für den Gebärmutterhals, jedoch unterteilen die neuen bindenden Vorgaben die Gruppe der anspruchsberechtigten Frauen in eine Gruppe Frauen von 20 bis 34 Jahren und eine Gruppe Frauen ab dem Alter von 35 Jahren. 

Grafik zum Cytologie-Screening

So ist für die Gruppe der Frauen bis 34 Jahren primär eine jährliche zytologiebasierte Früherkennung des Gebärmutterhalses vorgesehen. Die HPV-Diagnostik wird nur bei zytologischen Befunden der Gruppe II-p, II-g oder IIID1 ab dem Alter von 30 bis 34 Jahren mit einem HPV-Test in 6 – 12 Monaten durchgeführt. Hingegen werden zytologische Befunde der Gruppe II-p, II-g oder IIID1 bis zum Alter von 29 Jahren mit einem Pap-Abstrich in 6-12 Monaten kontrolliert. Bei den Gruppen III-p, III-g, IIID2, IV und V ist eine weitere Kontrolle/Abklärung in einer Dysplasiesprechstunde vorgesehen.

Grafik Ko-Testing

Für Frauen ab dem Alter von 35 Jahren ist zunächst eine Ko-Testung bestehend aus zytologischer Untersuchung und HPV-Test im Abstand von drei Kalenderjahren vorgesehen. In bestimmten Fällen entscheidet das Ergebnis des HPV Tests, wie das weitere Follow-up aussieht. Zum Beispiel: Ergibt sich ein Zytologiebefund der Gruppe I und ein positives HPV-Testergebnis bzw. ein Zytologiebefund der Gruppe IIID1 und ein negatives HPV-Testergebnis, soll nach 12 Monaten eine erneute kombinierte Untersuchung (Ko-Testung) stattfinden. Bei der Gruppe II-p, II-g und IIID1 erfolgt bei positivem HPV-Testergebnis eine weitere Kontrolle in der Dysplasiesprechstunde. Bei den Gruppen III-p, III-g, IIID2, IV und V ist eine weitere Kontrolle/Abklärung in einer Dysplasiesprechstunde bei den Frauen ab dem Alter von 35 Jahren unabhängig von dem Ergebnis des HPV Tests vorgesehen.

Immunzytochemische Methoden

Immunzytochemische Methoden können in der gynäkologischen Zytologie zur Bewertung und Analyse von unklaren Befunden und von erkannten Dysplasien zur Qualitätskontrolle in der zytologischen Diagnostik verwendet werden. Wir verwenden den CINtec® PlusTest der Firma Roche Diagnostic Deutschland GmbH.

Das duale immunzytochemische Nachweisverfahren kann sowohl auf Basis des konventionellen Pap-Abstrichs als auch auf Basis der Dünnschichtzytologie durchgeführt werden.

Hierzu wird der Abstrich im Falle einer konventionellen Zytologie entfärbt und anschließend dem immunzytochemischen Färbeprozess zugeführt. 

Da bei der Dünnschichtzytologie in der Regel ein Restvolumen an Zellen in der Transportlösung verbleibt, kann diese für das immunzytochemische Nachweisverfahren verwendet werden. Das zweifache immunzytochemische Nachweisverfahren erkennt die körpereigenen Proteine p16-INK4a und Ki-67.

Das Zellprotein p16-INK4a übt eine Kontrollfunktion innerhalb der Zellzyklusmechanismen aus und ist unter physiologischen Bedingungen gebunden. Liegt jedoch freies p16-INK4a vor, so kann dies in einen direkten Zusammenhang mit einer Veränderung der Zelle (Transformation) gebracht werden, die z.B. durch eine anhaltende Infektion mit HR-HPV-Typen verursacht wird. Bei einem positiven Nachweis von p16-INK4a färbt sich das Zytoplasma der betroffenen Zelle braun.

Grafik Cytopathologie

Der zweite Schritt verfolgt die Identifizierung des Zellproteins Ki-67. Dieses Protein kann während einer bestimmten Phase des Zellzyklus (Interphase) im Zellkern nachgewiesen werden und wird auch als Biomarker für die Zellproliferation bezeichnet. Sein positiver Nachweis führt zu einer Rotfärbung des Zellkerns.

Normalerweise, unter physiologischen Bedingungen, kommen beide Proteine nicht gleichzeitig innerhalb einer Zelle vor. Falls jedoch beide Proteine in einer Zelle nachgewiesen werden, so kann dies als Zeichen für eine weiter voranschreitende Läsion gedeutet werden (positives Testergebnis). Falls die Proteine nicht innerhalb einer Zelle nachgewiesen werden, ist das Testergebnis negativ. In diesem Fall ist die Rückbildung der beobachteten Läsion wahrscheinlich.

Nachweis Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae, sowie Multi-STI TEST

Neben der HPV-Diagnostik führen wir auch den Nachweis für weitere sexuell übertragbare Infektionen durch: den Nachweis für Chlamydien und Gonorrhö, sowie über den Multi-STI Test einen zusätzlichen Nachweis über Trichomonas vaginalis und Mycoplasma genitalium. Der Nachweis dieser Erreger erfolgt per PCR Technologie.

Bei Frauen wird entweder das Untersuchungsmaterial aus Urin oder aus Endozervixabstrichen, Vaginalabstrichen analysiert.  Bei Männern können ebenfalls Urinproben oder Urethralabstriche analysiert werden.

Weitere Laborverfahren

Automatisierte Färbe- und Eindeckstraße

Computerassistierte Dünnschichtzytologie

Histologische Einbett- und Schnittautomaten